>

الكشف عن إشارات DSF والمورثات المرمزة لها عند البكتيريا Xanthomonas translucens المسببة لمرض تخطط الورقة البكتيري على القمح

الملخص

يعد القمح المحصول الاستراتيجي الأول في سورية نظراً لأهميته الغذائية والاقتصادية، حيث يزرع مروياً أو بعلياً على امتداد مساحات واسعة في جميع المحافظات. ويصاب القمح بالعديد من الآفات والممرضات، وأحد هذه الممرضات البكتيريا Xanthomonas translucens  المسببة لمرض التخطط البكتيري على القمح، والذي يؤدي إلى خسائر في الغلة تصل إلى 40٪ . حيث أدى هذا المرض إلى خروج الصنف جزيرة 17 من الزراعة، وكذلك ينتشر في مناطق زراعة القمح المختلفة ووجود عدة سلالات من المسبب لذلك هدف هذا البحث إلى دراسة البكتيريا المسببة له والكشف عن إشارات الـ DSF والمورثات المرمزة لها عند البكتيريا Xt ومقارنتها بالبكتيريا Xanthomonas campestris pv. campestris المسببة لمرض اسوداد أعصاب أوراق الملفوف كشاهد لأهمية هذه المورثات وهذه الإشارات في التحكم بعوامل القدرة الإمراضية المختلفة التي تمتلكها البكتيريا للتأثير على عوائلها. أدت نتائج هذا البحث الى عزل البكتيريا Xt من القمح والبكتيريا Xcc من الزهرة والملفوف وتوصيفها, كذلك تم تصميم بادئات متخصصه بالمورثة rpfB عند كليهما حيث يسمح زوج البادئات المتخصص بالبكتيريا Xt بتضخيم قطعه من المورثة rpfB بوزن جزيئي   bp75 وزوج البادئات المتخصص بالبكتيريا Xcc بتضخيم قطعه من المورثة rpfB بوزن جزيئي  bp507, وأبدت هذه البادئات تخصصية وكفاءه عالية في الكشف عن البكتيريا وعن تعبير مورثة الـ rpfB بتطبيق تقانتي colony-PCR و RT-PCR على التوالي. كما دُرس تأثير وسط الزرع على نمو البكتيريا Xt و Xcc فكان أفضل نمو للبكتيريا Xt في وسط GYS ثم وسط Wilbrink والبكتيريا Xcc في الأوساط NB و YPG و KB و GYS دون فروق معنوية, كذلك درست البصمة الوراثية للعزلات المتحصل عليها ومقارنتها مع أنواع بكتيرية تابعة للجنـــس بتطبيق تقانات rep-PCR ورســـــم شجرة القرابة الوراثية التي جمعت عزلات Xt و Xcc في عنقود وباقي الأنواع المدروسة في عنقود ثانٍ. استخلصت إشارات الـ DSF عند البكتيريا Xt عند الزمن 48 ساعة و 96 ساعة من التحضين في وسط NB عند درجه حراره 30°c وتم تحليلها بتطبيق تقانة TLC حيث أظهرت نتائج الرحلان على أطباق TLC وجود ثلاث بقع x1 ,x2 وx3 بمعامل احتفاظ RF(0.08 ,0.28 ,0.97) على التوالي وتركيز أعلى عند الزمن 48 ساعة مقارنة مع 96 ساعة, كذلك بينت نتائج دراسة تعبير المورثة rpfB عند البكتيريا Xt ارتفاعه عند الزمن 2 و4 ساعات من التحضين مقارنة مع باقي الأزمنة 24 ,48 و72 ساعة من التحضين بينما توقف تعبير هذه المورثة عند الزمن 96 ساعة من التحضين عند درجة حرارة 30ºC.

الكلمات المفتاحية: القمح، التخطط البكتيري، استشعار النصاب العددي، بادئات متخصصة، البصمة الوراثية،Xt , Xcc , rpfB , DSF

Detection of DSF signaling molecules and its coding genes within Xanthomonas translucens which causes Bacterial leaf streak of Wheat

Abstract

Wheat is the primary strategic crop in Syria due to its nutritional and economic importance, as it is grown irrigated or rain-fed over large areas in all governorates. Wheat is infected by many pests and pathogens. One of these pathogens is the bacterium Xanthomonas translucens, which causes bacterial leaf streak disease on wheat, and can result in yield losses up to 40 %. This disease led to the removal of the variety Jazeera 17 from cultivation, and it also spreads in different wheat-growing areas and has several strains. Therefore, this research aimed to study the causative bacteria, detect DSF signals and their encoding genes in Xanthomonas translucens (Xt) and compare them with those in  Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc), the causing agent of cabbage black rot as a control to illustrate the importance of these genes and  signals in controlling the various pathogenicity factors that bacteria possess to influence their hosts. The results of this research led to the isolation and characterization of Xt isolate from wheat and Xcc isolate from cauliflower, Also to design specific primer sets for both using rpfB sequence. The specific primers of Xt amplify a 75 bp fragment of the rpfB gene. whereas the specific primers of Xcc amplify a 507 bp fragment of the rpfB gene. These specific primers showed high level of sensitivity and efficiency in detection the bacteria and in evaluation the expressed rpfB gene by within colony-PCR and RT-PCR technics, respectively. The effect of media on the bacterial growth of Xt and Xcc was also evaluated. Where the best growth rate of Xt was in GYS then in Wilbrink media; whereas, the best media for growing the bacteria Xcc were NB, YPG, KB, and GYS, without any significant differences. The genetic fingerprinting of the obtained isolates was studied and compared with those of bacterial species belonging to the Xanthomonas genus using rep-PCR technics. The unrooted phylogenetic tree demonstrated the Xt and Xcc isolates were gathered in one cluster; while, the other isolates were gathered in another cluster. The DSF molecule signals were extracted from the Xt bacteria 48 and 96 h post incubation in NB medium at 30ºC and were analyzed using TLC. The results of TLC showed the presence of three spots, X1, X2, and X3, with a retention factor(RF) of (0.08, 0.28,0.97) respectively, and the highest concentration was observed at 48 h as compared to 96 h. The results of the rpfB gene expression study within Xt revealed that rpfB gene was highly expressed at 2 and 4 h post incubation as compared to 24, 48 and 72 h; while, the expression of this gene stopped at 96 h post incubation at 30ºC.

Keywords: Wheat, bacterial leaf streak, Quorum sensing, Specific primers, genetic fingerprinting, Xt , Xcc  , rpfB, DSF